专家点评 Sci Signal︱叶子璐等通过定量磷酸化蛋白质组学揭示TGFβ信号通路的功能选择性

撰文︱叶子璐责编︱王思珍，方以一编辑︱杨彬薇

转化生长因子-β（TGF-β）信号转导由活化的TGF-β配体（TGF-β1、TGF-β2 或 TGF-β3）与相应的II型受体结合并招募I型受体形成复合物，然后招募其下游的Smad蛋白，并发挥转录调控作用[1]。TGF-β在细胞生长和分化、组织形成和转化中均有重要的作用，其变化可能引起包括炎症、纤维化和癌症等多种疾病。对小鼠和人类肿瘤的研究发现TGF-β信号通路在正常皮肤生物学和皮肤癌的发展和进展中的多重作用。然而，TGF-β通路中很多蛋白以及磷酸化位点的作用并未得到清晰研究。基于定量液相色谱-质谱的蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学已成为全面探索细胞信号转导的首选方法。因此，利用蛋白质组学研究分析单个TGF-β信号成分的作用，包括Smad4依赖性和Smad4非依赖性TGF-β通路之间的区别，能精确分析它们在多种细胞行为中的作用。

2022年11月22日，丹麦哥本哈根大学叶子璐博士等在Science Signaling作为封面文章发表了题为 “Characterization of TGF-β signaling in a human organotypic skin model reveals that loss of TGF-βRII induces invasive tissue growth”的研究。该研究利用定量磷酸化蛋白质组学技术在人体皮肤3D类器官模型中揭示了表皮发育和体内动态平衡对不同TGF-β信号通路的要求。

首先，研究者利用深度蛋白质组学鉴定验证了其体外皮肤3D类器官模型系统的生物学相关性。研究者之前结合基因编辑技术和人类N/TERT-1角质形成细胞3D类器官模型中研究了不同基因对于完全分化的人类表皮组织的形成和转化的重要性 [2]。在本研究中，通过蛋白质组学技术定量分析N/TERT-1细胞系与健康的人类表皮细胞，研究者在这两个样本中鉴定出超过11,000种蛋白质。进一步分析其蛋白组与激酶组后，定量数据表明两个样本高度相似，也证明其是研究TGF-β信号传导不同功能的适当模型。而后，研究者敲除了相应基因，生成了TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-βRII、Smad2、Smad3和Smad4蛋白缺失的N/TERT-1细胞系。使用基于TMTpro的定量（磷酸化）蛋白质组学，在SMAD4 KO和TGFBR2 KO细胞中分别分析Smad4依赖性和Smad4非依赖性TGF-β信号通路（图1）。

图1 在人体器官型皮肤模型中使用定量磷酸化蛋白质组学剖析TGF-β信号通路

（图源：Ye ZL, et al., Sci Signal, 2022）

研究者在其皮肤3D器官模型中研究TGF-β中基因在人体皮肤中的功能。在TGFB1 KO细胞中，3D模型显示多层增殖的K10和K1阴性细胞（图2）。然而，其未显示异常终末分化并形成发育良好的角质层。这些数据表明，角质形成细胞产生的TGF-β1抑制人角质形成细胞增殖和早期分化，但不影响终末分化。与之相反，SMAD4 KO细胞的角质层更薄，几乎没有上层，证实了其未分化的性质。SMAD2 KO 和 SMAD3 KO细胞中则没有显示出明显的表型。用TGFBR2 KO细胞生成的人类皮肤模型显示增殖和表皮增厚显着增加（图2）。此外，表皮的基底侧变得强烈裂开，具有明显的侵入性表型（图2）。此外，激光片层扫描显微镜扫描证明了TGFBR2 KO细胞迁移到富含胶原蛋白的结缔组织深处，在真皮室中形成侵袭性上皮细胞岛。总之，经典的TGF-β信号通路对于角质形成细胞增殖的调节以及早期和晚期分化至关重要。由TGF-βRII控制的Smad4依赖性和Smad4非依赖性信号通路则能够防止人角质形成细胞的转化和侵袭行为。

图2 野生型和各基因敲除型细胞在人体皮肤3D类器官模型中的分化

（图源：Ye ZL, et al., Sci Signal, 2022）

与SMAD4 KO细胞相比，TGFBR2 KO细胞中显示出更广泛的蛋白质组和磷酸化蛋白质组变化。鉴于在SMAD4 KO和 TGFBR2 KO 3D类器官模型中观察到的明显表型，研究者评估了这两种重要的TGF-β通路成分的如何影响细胞内信号通路。研究者对于SMAD4 KO和 TGFBR2 KO N/TERT-1 细胞系与其野生型细胞进行了基于TMTpro标记的定量蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析。此研究中共对 7903 种蛋白质进行了定量，其中756和126种蛋白质分别在TGFBR2 KO和SMAD4 KO样品中表达量有着显著的变化（图3）。在SMAD4 KO和TGFBR2 KO细胞差异表达的蛋白质中的功能富集分析中，SMAD4 KO样品中大部分功能富集类名也在TGFBR2 KO样品中富集。例如，SMAD依赖型TGF-β信号转导的关键靶转录因子RUNX1在两个样品中的丰度都显着降低，这与TGF-β缺失导致的上皮间质转化抑制一致。相比之下，在TGFBR2 KO细胞中差异表达的蛋白质代表了更广泛的，尤其是癌症标志相关的功能注释。研究者发现，TGF-βRII不仅控制细胞周期和细胞分化的SMAD4依赖性调节，而且对上皮稳态具有更广泛的影响。这是因为TGFBR2的缺失通过基质蛋白的减少影响细胞-基质相互作用，增加癌症相关细胞粘附蛋白的产生，以及促炎介质的激活。进一步通过对激酶组的分析，在TGFBR2 KO细胞中观察到MAPK级联，特别是ERK和p38通路的激活。同时，研究者鉴定并量化了与3588种蛋白质匹配的14,651个磷酸位点，其中11,846个是I类（定位概率大于 0.75）磷酸化位点。在这组磷酸化位点中，磷酸化氨基酸在磷酸丝氨酸 (pSer)、磷酸苏氨酸 (pThr) 和磷酸酪氨酸 (pTyr) 上的分布与其他大规模磷酸化蛋白质组学研究一致[3]。与野生型细胞相比，SMAD4 KO 和 TGFBR2 KO 样品中 426 和 1262 磷酸位点的相对丰度分别发生了显着变化。与蛋白质组中的分布类似，SMAD4 KO 样品中大多数受调节的磷酸位点也在TGFBR2 KO样品中被调节。正如预期的那样，大多数高功能磷酸化位点仅在TGFBR2 KO样品中受到调节。最突出的被调节磷酸位点之一HSPB1中的Ser82。HSPB1在Ser82上的磷酸化能够通过激活p38 MAPK并调控细胞迁移。研究者发现此位点在TGFBR2 KO样品中高表达，并且与MAPK中几种激酶丰度的显着增加一致。

图3 敲除TGFBR2和SMAD4引起的蛋白质组变化

（图源：Ye ZL, et al., Sci Signal, 2022）

阻断ERK或p38可逆转TGFBR2 KO模型中的侵袭性表型。为了验证增加的p38和ERK信号与观察到的TGFBR2 KO细胞侵袭行为的相关性，研究者用p38或ERK信号通路的选择性抑制剂处理TGFBR2 KO模型（图4）。研究者发现阻断ERK信号可逆转侵袭性表型，而阻断p38信号只能部分逆转此表型。在 SMAD4 KO模型中，抑制p38对表型没有影响，而抑制ERK部分逆转了延迟分化的表型。这些结果表明，在TGFBR2 KO模型中观察到的侵袭性表型是由于ERK和p38通路的激活。相反，SMAD4 KO 对分化的影响只能通过阻断ERK通路来恢复。此外，通过对器官型培养物中的磷酸化 ERK (pERK) 进行染色，研究者验证了在SMAD4 KO和TGFBR2 KO模型中观察到的ERK激活，并发现在SMAD4 KO和TGFBR2 KO培养物中整个表皮的pERK免疫标记增加和异常。在这两种情况下，ERK抑制都消除了pERK的表达。

图4 阻断ERK、p38或JAK可逆转TGFBR2 KO模型中的侵袭性表型

（图源：Ye ZL, et al., Sci Signal, 2022）

图5 TGFBR2和SMAD4敲除细胞中受影响的生物途径和表型总结

（图源：Ye ZL, et al., Sci Signal, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，本研究提供了一个分析框架，将人体皮肤3D类器官模型与基因编辑、定量蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学相结合，剖析了TGF-β 信号通路的基本成分的重要性。与 TGF-β信号传导的抗增殖作用一致，TGF-β1或SMAD4的缺失促进细胞循环并延迟表皮分化。TGF-βRII的缺失会同时消除SMAD4依赖性和SMAD4非依赖性下游信号传导，与SMAD4缺失相比，它对细胞增殖和分化的影响更强烈，并且会诱导侵入性生长。敲除TGFBR2减少了细胞-基质相互作用，基质蛋白的产生增加了癌症相关细胞-细胞粘附蛋白和促炎介质的产生，并增加了MAPK信号传导。抑制 ERK 和 p38 MAPK通路的激活可阻断TGF-βRII缺失后侵袭性表型的发展。然而，需要指出的是，此研究中所用模型其生理性有所欠缺，并且对于蛋白质组学产生的大量数据仍有待后续进一步从分子机制层面深入分析。

专  家  点  评
毛洋，中山大学药学院教授、博士生导师

由激酶介导的细胞信号通路是现代细胞生物学发展的基础，TGF-β生长因子家族及其下游激酶信号通路更是上世纪80年代就被发现并被不断研究的经典信号通路。然而，传统“点对点”的研究范式，局限于下游的单个蛋白是否被磷酸化、单一通路是否被激活、单一基因是否发生转录上下调。由于细胞信号通路的补偿（complement）和串扰（crosstalk），如何全面地对信号通路的复杂网络进行系统解析，仍是尚未解决的科学难题。哥本哈根大学蛋白质组学中心的叶子璐博士的这篇论文在此领域做出了难得的尝试。该论文使用基于高分辨率质谱的蛋白质组学和磷酸化修饰组学，结合基因敲除技术，对TGF-β下游SMAD4依赖的信号网络进行了特异性阻断，并与TGF-βRII自身缺失进行了蛋白质组、磷酸化修饰组层面的系统性比较。该研究发掘了在TGF-βRII缺失下细胞补偿性上调的信号网络，从而解释了3D皮肤类器官（organoid）中该细胞侵袭性的细胞表型。从方法学角度，叶子璐博士的这项研究建立了一种 “自上而下”对细胞信号网络的研究范式，非常期待该研究范式未来广泛应用于各种病理模型的机制研究，和应用于除TGF-β之外的其他信号通路的系统性分析。

原文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/scisignal.abo2206

第一作者：叶子璐（左）；通讯作者：Jesper Olsen（中），Hans Wandall（右）

（照片提供自：叶子璐课题组）

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参考文献（上下滑动阅读）

[1] J. Massague, TGFβ signalling in context. Nat. Rev. Mol. Cell Biol.13,616–630 (2012).

[2] S. Dabelsteen, E. M. H. Pallesen, I. N. Marinova, M. I. Nielsen, M. Adamopoulou, T. B. Rømer, A. Levann, M.M. Andersen, Z. Ye, D. Thein, E. P. Bennett, C. Büll, S. J. Moons, T. Boltje, H. Clausen, S. Y. Vakhrushev, I. Bagdonaite, H. H. Wandall,Essential functions of glycans in human epithelia dissected by a CRISPR-Cas9-engineered human organotypic skin model. Dev. Cel l 54,669–684.e7 (2020).

[3] T. S. Batth, M. Papetti, A. Pfeiffer, M. A. X. Tollenaere, C. Francavilla, J. V. Olsen,Large-scale phosphoproteomics reveals Shp-2 phosphatase-dependent regulators of Pdgf receptor signaling. Cell Rep. 22,2784–2796 (2018).

本文完